تقلبات در شیر و روش های تشخیص آن

هر گونه دخل و تصرفی در ترکیبات شیر (شامل افزودن آب ، گرفتن چربی ،‌افزودن آب نمک ، آب  پنیر ، شیر خشک و اوره ....) ، یا افزودن مواد خنثی کننده (مثل سود سوز آور ،‌کربناتها ، بی کربناتها و ...)‌و یا مواد بازدارنده رشد میکروبی (از قبیل آب اکسیژنه ، فرمالین ، بورات ها ، سورباتها  و آنتی بیوتیک و ... ) به عنوان تقلب محسوب می گردد .

مقدمه1 ـ تقلبات مربوط به دخل و تصرف در ترکیبات شیر

1 ـ 1 ) تشخیص و تعیین آب افزوده شده به شیر

 1 – 1 – 1 ) تشخیص توسط ارزیابی وزن مخصوص شیر

 1 -1-2) تعیین نقطه انجماد

 1-1-2-1) تعریف

1-1-2-2)اصول روش1

-1-2-3) روش تعیین نقطه انجماد

 1-1-2-3-1) روش کار با کریسکوپ غیر اتوماتیک(دستی)

1-1-2-3-2) روش کار با کریسکوپ ترمیستوری

1-1-2-4) محاسبه نقطه انجماد

1-1-2-5) گزارش آزمایش

1-1-2-6) تفسیر نتایج و محاسبه درصد آب اضافی

1-2) تشخیص گرفتن چربی یا خامه گیری از شیر کامل

1-2-1) تعیین وزن مخصوص شیر

1-2-2) تعیین میزان درصد چربی

1-2-2-1) روش موژونیه(روش مرجع)

الف)لوازم و مواد مورد نیاز

ب) روش آزمون

1-2-2-2) روش ژربر(روش روتین)

الف)اساس روشب) وسایل و مواد لازمج) روش آزمایش

د) تکرار پذیری

هـ) گزارش آزمایش

1-3) تشخیص نمک در شیر

 1-3-1 ) روش کیفی (روش سریع )

1-3-2 ) روش کمی

الف ) وسایل و مواد لازم

ب ) روش آزمایش

1-4 ) تشخیص شیر بازساخته (شیر خشک ) در شیر خام

الف ) روش آزمون

 ب ) روش های تشخیص و تایید

1-5 ) تشخیص آب پنیر افزوده شده به شیر خام

 1-5-1 ) اندازه گیری پروتئین شیر با روش گلدال

  الف ) اساس روش

 ب ) وسایل و مواد لازم

 ج ) روش کار

 د ) محاسبه و تفسیر نتایج

 ه) تکرار پذیری

 1-5-2 ) اندازه گیری کازئین

 1-5-3 ) اندازه گیری پروتئین های سرم

 1-6 ) روش  تشخیص پرمیت افزوده شده به شیر خام

 1-6-1 ) تعیین وزن مخصوص شیر

 1-6-2 ) تعیین پروتئین تام

 1-6-3) تعیین لاکتوز به روش پلاریمتری (مرجع )

 الف ) وسایل و مواد لازم

ب) روش کار

 ج) محاسبه

 1-6-4 ) اندازه گیری خاکستر شیر

 الف ) وسایل و مواد لازم

 ب ) روش کار

 ج ) محاسبه

 1-7 ) تشخیص اوره در شیر خام

 1-7-1 ) تعیین پروتئین تام

 1-7-2 ) تعیین کازئین

 1-7-3 ) تعیین پروتئین های سرم

 1-7-4 ) تعیین ازت غیر پروتئینی

 1-8 ) تشخیص قند افزوده شده به شیر

  الف ) وسایل و مواد لازم

 ب ) روش آزمایش

1-9 ) تشخیص چربی های جایگزین شده در شیر

 1-9-1 ) اندازه گیری اندیس رایشر میسل

 الف ) دستگاهها و مواد لازم

 ب ) روش آزمون

 ج) محاسبه

1-9-2 ) اندازه گیری اندیس پولنسک

 الف ) روش آزمون

ب ) محاسبه

 2- تشخیص مواد خنثی کننده در شیر

 2-1 ) روش تشخیص کربناتها و بی کربناتها

 2-1-1) تشخیص جوش شیرین ( روش سریع )

 2-1-2 ) تعیین قلیائیت خاکستر

 الف ) وسایل و مواد لازم

 ب ) روش آزمون

ج ) محاسبه

 3- تشخیص مواد بازدارنده رشد میکروبی در شیر

 3-1 ) جستجوی آنتی بیوتیکها

 3-1-1 ) تست انعقاد

 الف ) اساس آزمایش

 ب ) وسایل و مواد لازم

 ج ) روش آزمایش

 3-1-2 ) استفاده از کیت های تشخیص آنتی بیوتیک

 3-2 ) تشخیص باقیماده مواد پاک کننده و ضدعفونی کننده

 3-3 ) تشخیص آب اکسیژنه در شیر خام

 3-3-1 ) تشخیص به وسیله گایاکل

 الف ) مواد شیمیایی لازم

 ب ) اساس روش

 ج ) روش آزمون

 3-3-2 ) تشخیص بوسیله اورتووانادیت

 الف ) مواد شیمیایی لازم

 ب ) روش آزمون

 3-4 ) تشخیص فرم آلدئید

 الف ) مواد لازم

ب ) روش آزمون

 3-5 ) تشخیص هیپوکلریت ها

 الف ) مواد لازم

ب ) روش آزمون

بررسی شیر خام از نظر خلوص باید قبل از تحویل شیر به وسیله کارخانه انجام پذیرد . در ضمن این بخش مربوط به بند (2- 5 ) شرح خدمات اجرای مطالعات می باشد .

1-            تقلبات مربوط به دخل و تصرف در ترکیبات شیر :

-1     ) تشخیص و تعیین آب افزوده شده به شیر

 1-1-1) تعیین وزن مخصوص شیر :   وزن مخصوص یا دانسیته شیر کامل در 15 درجه سانتی گراد حدود 028/1 تا 033/1 گرم بر سانتی متر مکعب است .

 تعیین وزن مخصوص دارای اهمیت زیادی است .

چنانچه وزن مخصوص شیر با ارقام فوق مطابقت نداشته باشد ممکن است در شیر دخل و تصرفی صورت گرفته باشد . افزودن آب به شیر موجب کاهش وزن مخصوص شیر می گردد .

روشهای سنجش وزن مخصوص شیر عبارتند از :

تعیین وزن مخصوص به وسیله ترمولاکتودانسیمتر

الف ) وسایل و مواد لازم -         ترمولاکتو دانسیمتر -         استوانه شیشه ای یا آلمینیومی یا جنس مناسب دیگر با حجم 250 تا 300 میلی لیتر -         حمام آب گرم (بن ماری )‌

ب) روش آزمایشاگر نمونه شیر قبلاً سرد شده و خامه آن جدا شده است . آنرا در حمام آب گرم با دمای حداکثر  50 درجه سانتی گراد قرار دهید تا دمای شیر به حدود 40 درجه سانتی گراد برسد و به مدت 5 دقیقه آنرا در این دما نگه دارید . در این مدت شیر را به هم زده و یکنواخت کنید . سپس نمونه را سریعاً تا دمای 20ـ 15 درجه سانتیگراد با آب سرد خنک کنید تا حبابهای موجود در آن خارج شود.

بعد به آهستگی و بدون ایجاد کف ، شیر را داخل استوانه خشک و تمیز بریزید تا استوانه از شیر پر شود .سپس لاکتودانسیمتر را که قبلاً با نمونه شیر خیس کرده اید وارد شیر نموده و آن را رها کنید و مجددا آنقدر شیر به استوانه اضافه کنید تا سطح شیر به دهانه استوانه برسد و از آن لبریز گردد بعد از اینکه لاکتو دانسیمتر در حدو دو تا سه دقیقه بی حرکت ایستاد بر روی ستون مدرج آن ، درجه ای را که همتراز سطح شیب است قرائت نموده و بلا فاصله دما را نیز بخواندید .

هنگام قرائت دانسیته باید دقت کنید که چشم شما ، همتراز سطح بالایی شیر بوده و استوانه به حالت عمودی قرار گرفته باشد ترمولاکتو دانسی متر نباید با بدنه استوانه تماس داشته باشد . در صورتیکه دمای شیر 15 درجه سانتی گراد باشد عدد خوانده شده بر  روی بخش مدرج لاکتودانسی متر مستقیما دانسیته شیر را نشان می دهد . اما اگر دمای شیر بیشتر یا کمتر  ازc 15⁰  باشد . باید نتیجه را اصلاح نمود به این ترتیب که بین 10 تا 20 درجه سانتی گراد در ازای هر یک درجه دمای بیشتر یا کمتر از 15 درجه سانتی گراد  ، 2/0 به عدد خوانده شده اضافه نموده یا از آن کسر کنید .

توصیه می شود که در دمای کمتر از 10 درجه سانتی گراد یا بیشتر از 20 درجه سانتی گراد دانسیته را اندازه گیری نکنید .

یاد آوری : اعداد خوانده شده بر روی ستون مدرج لاکتودانسیمتر ، دو رقم آخر وزن مخصوص شیر است . مثلا عدد 30 به معنای آن است که دانسیته شیر 030/1  می باشد .

تعیین وزن مخصوص به کمک پیکنومتر

 الف ) وسایل و مواد لازم -         پیکنومتر (ظرف شیشه ای به گنجایش 100 میلی متر مجهر به دماسنج ) -         ترازوی حساس ازمایشگاهی -         انکوباتورc15⁰  ب ) روش آزمایش ابتدا وزن پیکنومتر خالی و خشک و تمییز یا در دمایc 15⁰ به دست آورید سپس آنرا یک بار با شیر c 15⁰  و یک بار با آب مقطر c 15⁰  پر کرده توزین نمایید.وزن مخصوص شیر از رابطه زیر به دست می آید.

وزن پیکومتر خنثی-  وزن پیکنو متر پر از شیر

وزن مخصوص

وزن پینکو متر خنثی – وزن پینکو متر پر از آب

1 ‌ـ 1 ـ 2 ) تعیین نقطه انجماد در صورت افزودن آب به شیر ، غلظت نمک ها و لاکتوز محلول در سرم کاهش می یابد و بر اثر رقیق شدن شیر نقطه انجماد آن تدریجاً به سمت نقطه انجماد آب نزدیک می شود.

در اکثر مناطق جهان ، نقطه انجماد 533/0 – درجه هورت ورت ( HORTVET ) معادل 518 /0- درجه سانتی گراد را به عنوان انجماد طبیعی شیر پذیرفته اند .

نقطه انجماد با عواملی مثل فصل ،سن ، نژاد ، تغذیه ، و همچنین تخمیر شیر ویا انجماد شیر قبل از آزمایش تغییر می نماید. اندازهگیری نقطه انجماد شیر خام دقیق ترین روش تشخیص آب اضافی و محاسبه درصد آب اضافی است. نمونه های شیر با اسیدیته بیشتر از 17 درجه درنیک انجماد صحیح شیر را نشان نمی دهد.1

 – 1 – 2 – 1 ) تعریف نقطه انجماد دمایی است که در آن دما فاز مایع و فاز منجمد در یک حالت تعادل قرار دارد .

1 – 1 –2 – 2 ) اصول روشدر دستگاههای تعیین نقطه انجماد شیر به سرعت تا دمای پایین تر از نقطه انجماد سرد می شود( بدون اینکه منجمد گردد) سپس به وسیله ضربه مکانیکی دما به سرعت افزایش یافته و روی دمای انجماد نمونه شیر مورد آزمایش حدود 20 ثانیه ثابت می ماند( در این مدت باید نقطه انجماد قرائت شود) و سپس دمای نمونه تا رسیدن به دمای محفظه برودت کاهش می یابد.برای تعیین نقطه انجماد از دستگاهی بنام کریوسکوپ استفاده می شود که ممکن است ساده و دستی و غیر اتوماتیک بوده و یا الکتریکی و ترمیستوری باشد که در هر حال اصول کار مشابه است .

1-1-2-3) روش تعیین نقطه انجمادآماده سازی نمونه ها به ترتیب زیر صورت می گیرد:

-           قبل از نمونه برداری ، محموله شیر کاملاً یکنواخت شود به گونه ای که نمونه نماینده کل محموله باشد .

-         بهتر است نمونه بلافاصله بعد از نمونه برداری آزمایش شود. در صورت لزوم می توان نمونه ها را در دمای کمتر از 0 تا 5 درجه سانتی گراد نگه داری کرد .

-         اسیدیته شیر را هم زمان با اندازه گیری نقطه انجماد تعیین نمایید.

  1 – 1 – 2 – 3 – 1 ) روش کار با کریوسکوپ غیر اتوماتیک ( دستی ) کریوسکوپ دستی شامل یک مخزن عایق مخصوص ماده مولد سرما ( یخ و نمک ) و یک لوله انجماد اصلی که نمونه شیر در آن ریخته می شود . لوله انجماد یک استوانه شیشه ای است که انتهای فوقانی آن بوسیله در پوش پلاستیکی منفذ دار مسدود می گردد. از منفذ در پوش ، یک دما سنج و یک به هم زن کوچک عبور می کند. همچنین کریوسکوپ دارای یک بهم زن فلزی برای بهم زدن مخلوط مولد سرما و یک دما سنج برای کنترل دمای مبرد می باشد. مخزن کریوسکوپ دارای سر پوشی است که ضمائم فوق از آن عبور می کند.برای اندازه گیری نقطه انجماد ، مخزن را تقریباً تا نیمه از قطعات کوچک یخ پر کرده و حدود 200 گرم نمک خوراکی یا نمک آزمایشگاهی به آن اضافه نموده و ظرف را تا  از آب پر می کنیم. سپس مخلوط را خوب به هم زده و دقت می کنیم درجه حرارت دما سنج بین 3- تا 5- درجه سانتی گراد قرار گیرد. حدود 40 میلی لیتر شیر را قبلاً خنک شده در موقع انجماد کاملاً تمییز و خشک وارد می کنیم. دما سنج مخصوص را از منفذ در پوش وارد شیر کرده و لوله انجماد را در مخزن قرار می دهیم. در این موقع ستون جیوه دما سنج پایین می آید. با بهم زن ، شیر را به آهستگی به هم زده و با انگشت ضربه های ملایمی به دما سنج وارد می کنیم تا جیوه در لوله مویی آن توقف نکند، هنگامی که دما سنج تقریباً نیم درجه سانتی گراد پایین تر از نقطه انجماد مورد نظر را نشان داد . از منفذ درپوش لوله انجماد ، یک قطعه کوچک یخ وارد نموده و به شدت شیر را بهم میزنیم تا از کاهش دما جلوگیری شود. پس از اضافه کردن یخ جیوه در ستون دما سنج بالا می رودو تا مجدداً با انگشت به دما سنج ضربه می زنیم . هنگامی که جیوه ثابت شد می توان نقطه انجماد شیر را قرائت کرد.

1- 1-2-3-2 ) روش کار با کریوسکپ ترمیستوری قبل از شروع آزمایش دستگاه را مطابق دستور العمل سازنده دستگاه و با استفاده از محلولهای استاندارد کالیبره نمایید . اگر به صورت مداوم از کریوسکوپ استفاده می کنید ،‌کنترل کالیبراسیون را هر ساعت یک بار تکرار نمایید .

 اندازه گیری نقطه انجماد نمونه شیر به ترتیب زیر صورت می گیرد :

 -         ظرف حاوی نمونه را چند بار به آرامی چرخانده و وارونه نمایید  تا نمونه شیر مخلوط شود .

 -      دو یا دو و نیم میلی لیتر (بر حسب دستور العمل سازنده دستگاه ) از نمونه را در لوله آزمایش مخصوص دستگاه که کاملاً خشک و تمیز است بریزید . مطمئن شوید که پراب (PROBE  ) و به همزن دستگاه عتمیز و خشک است . در صورت لزوم با استفاده از دستکمال کاغذی نرم و تمیز آنها را خشک کنید .

 -         لوله آزمایش حاوی نمونه را در دستگاه قرار دهید. نمونه شیر خنک شده و انجمادآغاز می شود .

 -      اگر نمونه به سرعت منجمد شود < یا اصلا منجمد نشود . نمنه دیگری آماده کرده و آزمایش را تکرار نمایید .

 اگر نمونه ای سریعا منجمد شود ، آن را در حمام آب گرم تا حدود 20 الی 40 درجه سانتی گراد گرم کرده و بعد از به هم زدن کامل نمونه ، آن را در حمام آب یخ تا حدود 10 درجه سانتی گراد  خنک کنید . سپس مجددا نقطه انجماد نمونه را اندازه گیری نمایید .

 -      هنگامیکه آزمایش کامل شد لوله آزمایش را خارج کنید ، ترمیستور تراب و به هم زن را با آب بشویید و سپس با دستمال کاغذی نرم آنها را خشک نمایید و مجددا با مقدار دیگری از همان نمونه آزمایش را تکرار کنید . اختلاف اعداد حاصل ازدو  آزمایش  نباید بیشتر ازH ⁰  004 /0 باشد . در غیر این صورت باید دو آزمایش متوالی دیگر بر روی نمونه های تازه شیر انجام شود .

 -         سرد کردن پراب :

 -      بعد از خاتمه آزمایش ، یک لوله آزمایش خالی را در محل مخصوص آن در دستگاه قرار داده و قسمت فوقانی دستگاه را به سمت لوله آزمایش هدایت کنید . تا پرا ب را خنک نگه دارد . در برخی کریوسکپ ها این عمل امکان ندارد . در این صورت قبل از اندازه گیری نقطه انجماد ، باید تراب به حد کافی خنک شده باشد و بدین منظور باید قبل از نمونه اصلی ، چند نمونه به دستگاه داده شود تا پراب کاملاً خنک شود .

   یادآوری :

 1-       نمونه هایی که منجمد نمی شوند ممکن است دارای میزان زیادی مواد محلول باشند که علت آن اسیدیته زیاد یا وجود آلودگی هایی مانند مواد پاک کننده یا کلراست .

 2-        نمونه های که انجماد اولیه آنها تاخیر می یابد ممکن است دارای بار میکروبی زیاد یا تعداد زیادی سلولهای سوماتیک باشند .

1-1-2-4 ) محاسبه نقطه انجماد  الف ) اگر دستگاه کاملاً کالیبره است  ، میانگین دو نتیجه نقطه انجامد قابل قبول را تا نزدیک ترین رقم سوم بعد از اعشار گرد کنید . روش گرد کردن به این ترتیب است که اگر مجموع نتایج دو ازمایش قابل قبول ، یک عدد فرد باشد میانگین باید به نزدیک ترین عدد زوج گرد شود

مثال :   نقطه انجماد H⁰میانگین  

     نتایج دو آزمایش متوالی 544/0

-       545/0-544/0 546/0

-       546/0 – 545/0   

ب – تکرار پذیری

 - اختلاف بین نتایج دو آزمایش متوالی که توسط یک آزمایشگر برروی یک نمونه انجام میشود نباید بیشتر از H004⁰ / 0 باشد .

- اختلاف بین نتایج دو آزمایش که برروی یک نمونه در دو آزمایشگاه انجام میشود نباید بیشتر از H 006⁰ /0  باشد .

 1-       1-2-5 ) گزارش آزمایش گزارش آزمایش باید شامل اطلاعات زیر باشد :

الف ) مشخصات کامل نمونه آزمایشگاهی و شرایط نگهداری نمونه

ب ) نقطه انجماد

پ) اسیدیته

ت) تاریخ نمونه برداری و آزمایش

ث) هرگونه اطلاعاتی که نشان می دهد نتیجه ممکن است قابل اعتماد نباشد

ج) تاریخ دریافت نمونه و تاریخ آزمایش

1-1-2-6 ) تفسیر نتایج و محاسبه درصد آب اضافی برای مقایسه و ارزیابی نقطه انجماد شیر مشکوک ، یک نقطه انجماد استاندارد وجود ندارد بلکه فقط احتمال وجود آب اضافی را در شیر دامداری به شرح زیر می توان تخمین زد :

1 ـ  اگر نقطه انجماد شیر H535⁰/0

-  یا کمتر باشد می توان به عنوان شیر عاری از آب اضافی پذیرفت.یادآوری :

نقطه انجماد شیر به صورت عدد منفی بیان می شود و هر چقدر مطلق آن افزایش یابد نقطه انجماد کمتر می شود یعنیH⁰ 536/0- کمتر از^H0 535/0 – است.

2– با وجود آنکه نمونه شیری با نقطه انجماد H0 534/0 – تا H0 530/0 – ممکن دارای آب اضافی باشد، اما برای قضاوت در مورد احتمال وجود آب اضافی کافی نخواهد بود و آزمایشهای مکمل ضرورت دارد.

3- شیری با نقطه انجماد ^H0 529/0 – یا بیشتر احتمال دارد دارای آب اضافی باشد. هر چقدر نقطه انجماد بیشتر باشد احتمال وجود آب اضافی افزایش می یابد.

4 -  شیری با نقطه انجماد ^H0 525/0 – یا بیشتر به احتمال بسیار زیاد دارای آب اضافی می باشد برای محاسبه درصد آب اضافی احتمالی باید حداکثر باید 48 ساعت بعد از آزمایش نمونه مشکوک ، از دوشش کامل دامداری نمونه برداری شده و نقطه انجماد آن اندازه گیری شود و در صورتی که نقطه انجماد شیر شاهد حداکثر ^H0 6 کمتر از نقطه انجماد شیر مشکوک باشد بدون آب اضافی محسوب خواهد شد.

5 – نمونه شیر شاهد یا مبنا عبارت است از نمونه مرکب از نمونه شیر دوشی عصر و شیر دوشی کامل صبح دامداری.

6 – محاسبه درصد آب اضافی : برای محاسبه درصد آب اضافی از فرمول زیر استفاده می شود: = W  درصد آب اضافی (وزن/وزن) =W نقطه انجماد شیر شاهد بر حسب ^H  0 =C نقطه انجماد شیر مشکوک بر حسب ^H  0  = D                 نمونه هایی که دارای آب اضافی هستند باید از نظر چربی ، لاکتوز و پروتیئن آزمایش شوند تا مساله افزایش آب تایید گردد .

تشخیص گرفتن چربی یا خامه گیری از شیر کامل 

2 ) تشخیص گرفتن چربی یا خامه گیری از شیر کامل :

2- 1 ) تشخیص توسط ارزیابی وزن مخصوص وزن مخصوص شیر تابع وزن مخصوص مواد جامد تشکیل دهنده شیر است . مقدار چربی در شیر طبیعی گاو وابسطه به نژاد ، تغذیه ، منطقه و غیره از 8/2 تا 5/4 درصد متفاوت می باشد . گرفتن چربی ز شیر به دلیل کمتر بودن وزن مخصوص چربی از سایر مواد متشکله شیر موجب افزایش دانسیته می گردد . وزن مخصوص شیری که به طور کامل چربی آنگرفته شده باشد بین 033/ 1 تا 035/1 است . تعیین وزن مخصوص شیر با توجه به سابقه دامداری می تواند تا حدودی نشانگر وضعیت شیر در رابطه باگرفتن چربی باشد . به هر حال در این مواقع علاوه بر دانسیته باید میزان درصد چربی شیر نیز به منظور تایید و یا رد احتمال خامه گیری  از شیر اندازه گیری شود . وزن مخصوص مطابق بند 1-1-2 ، تعیین می شود .

 1-2-2 ) تعیین میزان درصد چربی به منظور تعیین میزان درصد چربی دو روش مرجع و روش  روتین توصیه می شود . 1-2-2-1 ) روش موژونیه (روش مرجع )این روش به عنوان روش مرجع و به منظور کالیبراسیون آنالایزرهای مادون قرمز مثل میلکواسکن و یا دستگاههای مشابه به وسیله ISO  و IDF  توصیه می گردد. حساسیت اینروش در مورد شیر ، 02/0 درصد است .

 الف) لوا زم و مورد نیاز

-         فلاسک استخراج چربی MOJONNIER  با درپوش  چوب پنبه ای مناسب .

-         آون تحت خلاء مناسب برای حرارت 70 تا 75 درجه سانتی گراد

-         حمام آب گرم : برای نگهداری نمونه ها در حرارتC  1⁰  38 و 100 درجه سانتی گراد برای تبخیر حلال

-         ظروف توزین : بشر شیشه ای ^ml 250

-         ترازو : حساسیت^mg  1/0  یا 001/0 گرم

-         دسیکاتور : با رطوبت گیر مناسب که بعد از از جذب رطوبت تغییر رنگ دهد مثل سولفات مس

-         بهم زن مکانیکی

-         مصرف فنل فتالین : 5/0 درصد الکلی ( اتانل ) وزن به حجم

-         پایه نگهداری ظروف استخراج چربی

-         هیدراکسید آمونیوم : وزن مخصوص 9/0 

-         اتانل

-         اتیل اتر

-         پترولیوم اتر با نقطه جوش 30 تا 60 درجه سانتی گراد

-         آب مقطر

  ب ) روش آزمون نمونه های شیر را تا دمای C  1⁰  38 گرم نمایید .  و بهم بزنید تا یکنواخت گردد. ظروف توزین را در آون خشک کرده و در دسیکاتور تا دمای محیط خنک کنید. فلاسک موژونیه خالی را همراه یک چوب پنبه خشک و تمیز وزن نمایید . 10 گرم از نمونه شیر یکنواخت شده را داخل فلاسک استخراج چربی به دقت وزن کنید . 5/1 میلی لیتر هیدراکسید آمونیوم و 3 قطره معرف فنل فتالین به آن بی افزایید .

درپوش فلاسک را بسته و مختوی را خوب به هم بزنید .سپس 10 میلی لیتر اتیل الکل به آن اضافه نمایید .

در فلاسک رابسته ،‌به مدت یک دقیقه با استفاده از به هم زن مکانیکی آنرا مخلوط نمایید .به این مخلوط 25 میلی لیتر اتیل اتر اضافه کرده و مجددا به مدت یک دقیقه به هم بزنید .و بالاخره 25میلی لیتر پترولیوم اتر به آن بیافزایید  و به مدت یک دقیقه به هم بزنید . توجه داشته باشید که فشار ایجاد شده در اثر تصعید گاز خارج شود . فلاسک را با دور 600 دور در دقیقه حداقل به مدت 30 ثانیه سانتریفوژ  نمایید و یا آنرا ثابت نگه ارید تا مایع رویی شفاف شود . محلول اتر را داخل یک بشر که قبلا وزن کرده اید به آرامی بریزید . مراقب باشید هیچ ماده جامد و یا فاز آبی در بشر نریزد . برای بار دوم مقدار 15 میلی لیتر اتر پترولیوم فلاسک استخراج چربی اضافه کنید و فلاسک را به مدت 1 دقیقه کاملاً به هم بزنید و سپس سانتریفوژ کرده و بخش اتر را درون بشر روی نمونه قبلی خالی نمایید . در صورت لزوم عمل استخراج چربی را برای سومین بار با 15 میلی میتر اتر پترولیوم تکرا رکنید . حلال را روی حمام بخار تبخیر نمایید . این عمل باید زیر هود انجام شود . دقت کنید حلال به اطراف پاشیده نشود . بعد از تبخیر حلال ظرف حاوی چربی را در یک آون تحت خلاء در حرارت 70 تا 75 درجه سانتی گراد حداقل در مدت 30 دقیقه خشک نمایید . ظرف را در دسی کاتور تا دمای محیط خنک نموده و آنرا توزین نمایید. عمل خشک کردن را تا رسیدن به وزن ثابت ادامه دهید. 

 100 * ( وزن ظرف – وزن ظرف + چربی)   = درصد چربی          وزن نمونه 

توجه : به منظور اطمینان از صحت آزمایش همواره نمونه یک شاهد با استفاده از آب مقطر به جای نمونه شیر مورد آزمایش قرار گیرد . باقیمانده مواد جامد در ظرف شاهد نباید از 002/0 گرم بیشتر باشد. چنانچه باقیمانده مواد جامد بیش از این مقدار باشد دلیل آن غیر مناسب بودن مواد و یا کثیف بودن ظرف مورد آزمایش است.

1 – 2 – 2 – 2 ) روش ژربر ( روش روتین)

الف ) اساس روش عبارت است از جدا کردن چربی در بوتیرومتر ( چربی سنج) توسط اسید سولفوریک غلیظ که ترکیبات آلی غشاء گلبولهای چربی ، لاکتالبولین و لاکتوز را اکسیده و هیدرولیز می کند و افزایش آمیل الکل ، جدا شدن فاز چربی را تسریع نموده و مرز دقیق ستون چربی را مشخص می کند. ب) وسایل و مواد لازماسید سولفوریک :دانسیته در^c 20⁰ (003/0 818/1) عاری از رنگ و هرگونه ماده خارجی.یادآوری 1 : دانسیته فوق معادل 90 تا 91 درصد وزنی اسیدسولفوریک است. از غلظتهای بیشتر یا کمتر نباید استفاده کنید. اسید غلیظتر در دمای 65 درجه سانتیگراد باعث تغییر ترکیب آمیل الکل شده و در نتیجه آزمایش تاثیر می گذارد. اسید رقیق تر باعث کاهش اثر اکسید کنندگی شده و در نتیجه غشای گلبولهای چربی کاملاً از بین نمی رود و به دلیل ذراتی که در بوتیومتر به وجود خواهد آمد ستون چربی کدر می گردد.

یادآوری 2 :برای تهیه اسید سولفوریک آزمایشگاهی از اسید سولفوریک خالص ، باید ابتدا دانسیته اسید سولفوریک خالص را تعیین نمود و سپس نسبت کافی از اسید را به میزان لازم آب اضافه کنیم زیرا افزودن آب به اسید باعث تولید حرارت و پاشیده شدن اسید به اطراف خواهد شد غلظت زیاد اسید موجب سیاه شدن ستون چربی و غلظت کم باعث کدر شدن ستون چربی می گردد.

-         الکل ایزوآمیل ( الکل آمیلیک) : دانسیته در ^c 20⁰ (003/0 811/0) و نقطه جوش ^c132⁰- 128 عاری از آب ، اسید ، چربی و فورفورال. الکل ایزوآمیل باید در ظروف دربسته در محل تاریک نگهداری شود .قبل از استفاده از ظرف حاوی الکل ایزوآمیل باید آنرا کنترل نمایید. به این منظور، 10 میلی لیتر اسید سولفوریک را در بوتیرومتر شیر ریخته و سپس 11 میلی لیتر آب مقطر و یک میلی لیتر الکل ایزوآمیل به آن اضافه کنید. بوتیرومتر را تکان داده و مشابه روش شیر آنرا سانتیفوژ نمایید. اگر در بوتیرومتر ذرات روغن مشاهده شود، الکل ایزوآمیل قابل استفاده نمی باشد.همچنین چربی شیر را با استفاده از الکل تازه و الکل کهنه اندازه گیری کنید و اختلاف نتایج نیاید 05/0 درصد بیشتر باشد.

-         بوتیرومتر شیر ( چربی سنج) نوع ژربر همرا با درپوش پلاستیکی ( فشنگی) و کلید مخصوص

-         پایه نگهدارنده چربی سنج از جنس فولاد ضد زنگ یا پلاستیک مناسب

-         حمام آب گرم مخصوص بوتیرومتر 65 درجه سانتی گراد ( در صورت امکان)

-         سانتریقوژ از جنس استیل با پوشش ضد اسید ـ سرعت ( 100 1100) دور در دقیقه – دمای 65 درجه سانتی گراد

-         پی پت های اتو ماتیک ( خودکار ) 10 میلی لیتر ی برای اسید سولفوریک و یک میلی لیتری برای الکلی ایزو آمیل

-         پی پت مخصوص شیر از نوع ژربر با حجم 11 میلی لیتر در 20 درجه سانتی گراد

-         لامپ ایمنی قرائت چربی سنج ( در صورت امکان )

-         دستکش و عینک ایمنی

-         هیدرومتر اسید سولفوریک و هیدرومتر آمیل الکل

-         ج ) روش آزمایش

-         - آماده سازی نمونه :* دمای نمونه شیر باید حدود 20 درجه سانتی گراد باشد .

* ظرف حاوی نمونه را به آهستگی تکان دهید تا یکنواخت شود

* در صورت جدا شدن قشر خامه ،‌نمونه را تدریجا تا دمایc⁰  40 _  c 35⁰  گرم کرده و ضمنا آن را به هم بزنید . ا ز به هم زدن شدید نمونه خود داری کنید .سپس نمونه را تا دمای 20 درجه سانتی گراد خنک کنید .

* بعد از تنظیم دمای نمونه شیر 3 تا 4 دقیقه آن را بیحرکت قرار دهید تا حبابهای هوا خارج شود .

* با توجه به اینکه حجم پی پت مخصوص شیر در 20 درجه سانتی گراد تنظیم شده است .هرگونه تغییری در دمای نمونه ، حجم مقدار شیر را تغییر خواهد داد. حبابهاب هوا نیز باعث کاهش دانسیه شیر شده و مقدار شیر برداشت شده توسط پی پت را کاهش خواهد داد. -        

 اندازه گیری چربی:

         قبل از شروع کار از عینک مخصوص وعینک ایمنی استفاده کنید .

         تعداد 2 بوتیرومتر را در پایه مخصوص آن قرار داده و 10 میلی لیتر اسید سولفوریک درون آنها بریزید .به صورتیکه دهانه بوتیرومتر به اسید آغشته نشود .

         ظرف حاوی نمونه شیر را 3 یا 4 بار بادقت وارونه نمایید تا یکنواخت شود و بلافاصله 11 می لی لیتر شیر را باپی پت مخصوص به بوتیرو متر منتقل کنید به صورتی که شیر با دهانه بوتیرومتر تماس پیدا نکند . ضمنا نوک پی یت را به دیواره داخلی بوتیرومتر تکیه داده و به آهستگی شیر را تخلیه کنید تا شیر به صورت لایه ای در سطح اسید قرار گیرد و با آن مخلوط نشود . در مرز بین شیر و اسید نباید تغییر رنگ  به قهواه ای مشاهده شود .

         یک میلی لیتر الکل ایزوآمین را با پی پت به بوتیرومتر اضافه نموده و درب  بوتیرومتر را محکم ببندید .

         بوتیرومتر را با استفاده از دستکش در دست گرفته و تکان دهید تا محتویات بوتیرومتر کاملاً مخلوط شده و لخته هضم گردد . سپس آنرا چند بار وارونه نمایید تا اسد باقی  مانده در ستون مدرج و حباب بوتیرومتر نیز با نمونه ترکیب شود . بر اثر مخلوط شدن اسید با شیر مقداری حرارت تولید می شود و گاز حاصل ممکن است باعث پرتاب کردن درب بوتیرومتر شده یا باعث شکسته شدن  بوتیرومتر گردد . به همین جهت هنگام مخلوط کردن نمونه باید در بوتیرومتر را  با یک پارچه نگه داریم یا آن را در لوله محافظ قرار دهید .

         بلافاصله بعد از مخلوط شدن محتویات بوتیرومترها ، آنها رادر سانتریفوژ قرار دهید به صورتیکه درپوش آنها در سمتپایین قرار گیرد . ضمنا بوتیرومترها باید کاملاً مقابل یکدیگر باشند .تا تعادل سانتریفوژ حفظ شد .سپس درب سانتریفوژر را بسته و آنرا روشن کنید . معمولاً یک دقیقه طول می کشد تا سانتریفوژ به سرعت مورد نظر برسد . (100 1100  دور در دقیقه ) نمونه ها را به مدت 4 دقیقه با سرعت لازم سانتریفوژ کنید .(مجموعا 5 دقیقه ) سانتریفوژ مجهز به زمان سنج و ترمز خودکار است و بعد از زمان لازم متوقف می شود . در مورد شیر هموژنیزه زمان 12 دقیقه است .

         بوتیرومترها را از سانتریفوژ خارج کرده و آنها را به مدت 5 دقیقه در حمام آب 65 درجه سانتی گراد قرار دهید (  به صورتیکه درپوش‌آنها در قسمت پایین قرار گرفته و فقط حبابهای انتهایی  بوتیرومترها از آب خارج باشد ) .

        بوتیرومترها را یکی یکی از حمام آب بیرون بیاورید و به حالت عمدی و در ارتفاعی نگهدارید که حلالب ستون چربی در مقابل چشم قرار گیرد . خط مرزی پایین ستون چربی را با کید مخصوص درب بوتیرومتر روی نزدیک ترین درجه « درصد » بوتیرومتر قرار داده و سپس درجه ای را که در تماس با پایین ترین نقطه هلال سطح  فوقانی ستون چربی می باشد بخوانید .درجه پایینی را از درجه بالایی کم کرده و به عنوان درصد چربی ثبت نمایید . سپس بوتیرومتر بعدی را حمام آب خارج کرده و مراحل بالا را تکرار کنید .

یاد آوری :

 1-       اگر چشم شما و هلال چربی در یک سطح نباشد ، درصد چربی صحیح را نمی توانید قرائت نمایید .

2-       در صورت امکان از لامپ ایمنی قرائت چربی سنج استفاده کنید .

 3-       نتیجه آزمایش باید با تقریب 05/0 درصد خوانده شود . با این روش نمی توان نتیجه دقیق تری به دست آورد .

 4-       اگر هلال ستون چربی بر درجه بندی بوتیرومتر منطبق شود ، همان را بخوانید .

 5-       اگر هلال ستون چربی بین درجه بندی ها قرار گیرد ، چربی را با تقریب 05/0 درصد بخوانید.

6-       به منظور جلوگیری از ماسیدن چربی در بوتیرومتر پس از قرائت چربی بوتیرومترها را تخلیه و با آب گرم و مایع صابون شسته و آبکشی نمایید و به صورت وارونه در جای مخصوص قرار دهید تا برای آزمایش بعدی آماده باشد .

 د) تکرار پذیری : اختلاف نتایج درصد چربی دو بوتیرومتر که همزمان توسط یک آزمایشگر آزمایش شده است نباید از 1/0 درصد بیشتر باشد .

هـ) گزارش آزمایشدر گزارش آزمایش باید مشخصات نمونه ، تاریخ آزمایش و روش کاربردی ثبت شود. اگر اختلاف بین دو آزمایش همزمان یک نمونه 1/0 درصد باشد ، میانگین آنرا گزارش نمایند.مثال: نتیجه بوتیرومتر یک : 2/3 درصدنتیجه بوتیرومتر دو : 3/3 درصدنتیجه تصحیح شده : 25/3 درصد

 تشخیص نمک در شیر 

  1 – 3 ) تشخیص نمک در شیرافزودن نمک به شیر خام به منظور پنهان کردن آب اضافی انجام می شود.افزایش محلول نمک در ماده خشک شیر تاثیر ناچیزی دارد اما نمک باعث کاهش محسوس نقطه انجماد خواهد شد و بنابراین آب اضافی را میپوشاند. نمک اضافی به آسانی قابل تشخیص است . طعم شور شیری که نمک اضافی دارد کاملاً مشخص است و چون میزان کلرورهای شیر بسیار کم است (09/0 درصد) مقادیر نمک اضافی را به آسانی می توان اندازه گیری نمود. به این منظور دو روش شرح داده می شود.

1 – 3 – 1 ) روش کیفی ( روش سریع)5 میلی لیتر نیترات نقره 34/1 گرم در لیتر را با چند قطره کرومات پتاسیم 5 درصد مخلوط نموده و سپس یک میلی لیتر از نمونه شیر مشکوک به آن اضافه می نماییم پدیدار شدن رنگ زرد دلیل وجود نمک در شیر است. درصورت ظهور رنگ قهوه ای آجری نمونه فاقد نمک می باشد.

1 – 3 – 2) روش کمیالف ) وسایل و مواد لازم

-         ترازوی آزمایشگاهی با حساسیت 01/0 گرم

-         ارلن مایر 250 میلی لیتری

-         بورت 50 میلی لیتری با تقسیمات 1/0 میلی لیتر

-         پی پت 10 میلی لیتری

-         کرومات پتاسیم (k2cro4) – محلول 10 درصد آبی

-         آب مقطر

-         نیترات نقره(AgNO3)  1/0 نرمالب ) روش آزمایش 10 گرم شیر را در یک ارلن مایر تمییز ریخته و پی پت را با 10 میلی لیتر آب مقطر بشویید وبه ارلن مایر اضافه کنید.1 میلی لیتر معرف کرومات پتاسیم اضافه کنید و آن را با نیترات نقره 1/0 نرمال تیتر نمایید.تیتراسیون را تا پیدایش رنگ قرمز مایل به  به قهوه ای کم رنگ ادامه دهید که به مدت 30 ثانیه پایدار بماند.  

محاسبه میزان نمک :      85 /5 * میلی لیتر نیترات نقره 1/0 نرمال  = کلرور سدیم %     وزن نمونه

1 – 4) تشخیص شیر باز ساخته ( شیر خشک) در شیر خام پودر شیر خشک بدون چربی ممکن است برای افزایش ماده خشک به شیر اضافه شود و یا بااستفاده از شیر خشک کامل شیر با ز ساخته تهیه و به شیر اضافه گردد. این گونه تقلب به دلیل اقتصادی نبودن به ندرت انجام می شود.

الف ) رو ش آزمون :

-         تهیه نمونه های شاهدبه منظور تعیین درصد اختلاط شیر خشک با شیر تازه تهیه نمونه های شاهد در ابتدای کار ضروری است .

-         مواد و لوازم مورد نیاز

         شیر تازه و سالم 1 لیتر بهتر از با نظارت بر امر شیر دوشی ب و به صورت مستقیم از دامداری برداشت گردد.

         شیر باز ساخته یک لیتر : با استفاده از شیر خشک کامل به نسبت 13 % ماده خشک ( 13 گرم پودر و 87 میلی لیتر آب معمولی ) و در مورد شیر خشک بدون چربی 10 گرم پودر و 90 میلی لیتر آب.

         مخلوط شیر تازه و باز ساخته از 0% تا 100 % حجم هر یک از نمونه ها 100 میلی لیتر باشد .

         نمونه 0% فاقد شیر خشک 10% با 10 میلی لیتر شیر باز ساخته و 90 میلی لیتر شیر تازه و در نهایت نمونه 100 % فقط حاوی شیر باز ساخته می باشد .

         کاغذ صافی وا تمن نمره 40 به تعداد کافی

         لوله آزمایش 20 میلی لیتری تمیز و خشک به تعداد کافی برای آزمایش فسفاتاز

         کیت لاتوگنوست

         پی پت های 1 و 5 و 10 و 24 میلی لیتری تمیز و خشک به تعداد کافی تمیز و خشک

         اتو و یا بن ماری 37 درجه سانتی گراد

         جای لوله

         لوله آزمایش 25 میلی لیتری در پیچ دار به تعداد کافی

        اسید استیک 10 % ، 200 میلی لیتر

         هیدراکسید سدیم 5% ، 500 میلی لیتری

         سانتری فوژ ژربر با 700 دور در دقیقه

         آب مقطر 37 درجه سانتی گراد ( 1 پی ست محتوی یک لیتر آب مقطر همواره در اتو و 37 درجه سانتی گراد آماده باشد )

ب) روش های تشخیص و تایید

1 ) آزمایش های حسی : میزان کف و تغییر طعم را در کلیه نمونه های شاهد بررسی کنید .برای ارزیابی میزان کف می توان با تکان دادن ظرف و مشاهده جدار آن و یا داخل کردن یک میله شیشه ای داخل نمونه مقدار کف را ارزیابی کرد و مقدار را با علامت چند + ( برحسب میزان کف و حداکثر 5 + ) ثبت نمایید .

2) آزمایش صافی : 11 کاغذ صافی را بصورت قیف آماده نمائید و آنرا روی 11 ارلن مایر قرار دهید. حدود 50 میلی لیتر از نمونه های شاهد داخل هر یک از آنها بریزید. زمان عبور اولین قطره از صافی را در مورد نمونه ها یادداشت کنید.

3 ) آزمون فسفاتاز‌:با استفاده از کیت لاکتوگنوست و آب مقطر 37 درجه سانتیگراد روی کلیه نمونه و همچنین یک نمونه شیر خام جوشیده بعنوان شاهد منفی این آزمایش را انجام دهید و تغییر رنگ آبی به دودی و در نهایت قهوه ای را در کلیه نمونه ها مشاهده و ثبت نمایید.

4) آزمایش تاییدی :- 11 لوله آزمایش 25 میلی لیتری در پیچ دار برداشته و 20 میلی لیتر از نمونه های شاهد در آن بریزید و درصد اختلاط را روی لوله ها یادداشت کنید. نمونه ها را با استفاده از آب گرم تا دمای 30 درجه گرم کنید.

- به هر یک از لوله ها 3 میلی لیتر اسید استیک اضافه کرده در پوش لوله را گذاشته و خوب تکان دهید تا شیر منعقد شود.- لوله ها را بهمدت 5 دقیقه سانتریفوژ  نمایید. سپس سرم روی آن را خالی کرده و با آب مقطر مجدداً لوله را پر کنید . در لوله را ببندید آب و لخته را بهم زدن خوب مخلوط کرده و مجددا مثل دفعه قبل سانتریفوژ نمایید . عمل شستشوی لخته را 6 بار تکرار کنید .

- در مرحله آخر آب روی لخته را کاملاً تخلیه کرده روی لخته 10 میلی لیتر سود بریزید . در لوله را بسته لخته و سود را مخلوط کنید . نمونه ها را در جا لوله ای قرار داده ظهور رنگ زرد را بعد از 2 و حداکثر 3 ساعت ملاحظه نمایید .

 - با نگهداری رنگهای نمونه مای شاهد درصد اختلاط نمونه شیر مشکوک را می توان ارزیابی نمود .

 1- 5 ) تشخیص آب پنیر افزوده شده به شیر خام افزودن آب پنیر به شیر موجب تغییرات زیر در ویژگیهای شیر می گردد : -         کاهش وزن مخصوص شیر حدود 026/1 تا 028/1

-         کاهش درصد کازئین نسبت به پروتئین تام

-         افزایش پروتئین های سرم (لاکتالبومین  و لاکتوگلوبولین )

-         در شیر کامل نسبت کازئین ، پروتئین های سرم ، مواد ازته غیر پروتئینی به مواد ازته کل  بصورت زیر است : کازئین

                               پروتئین های سرم

                              ازت غیر پروتئینه78%  

                17%    

   5%به منظور کشف آب پنیر در شیر خام تعیین درصد کازئین و پروتئین های سرم  ضروری است .

روش کلدال به عنوان روش مرجع برای اندازه گیری  نیتروژن کل می باشد . از آنجایی که برای اندازه گیری کازئین و پروتئین های سرم از این روش استفاده می شود .شرح روش ضروری است.

1-5-1 ) اندازه گیری پروتئین شیر با روش کلدال ( kjeldahl  )

الف ) اساس روش عبارت است از تخمین نیتروژن کل ماده غذایی و تبدیل درصد نیتروژن به پروتئین ( با فرض اینکه کل نیتروژن در ماده غذایی به صورت پروتئین است )  با استفاده از یک ضریب تبدیل بر اساس درصد نیتروژن در پروتئین .  ضریب تبدیل

 * درصد نیتروژن = درصد پروتئین 

 100= ضریب تبدیل

 درصد نیتروژن در پروتئین  در مورد شیر و فرآورده های آن درصد نیتروژن مساوی 66/15 و ضریب تبدیل مساوی 38/6 است .

اصول کلی روش کجلدال بشرح زیراست :

میزان معینی از نمونه را با استفاده از اسید سولفوریک  غلیظ  (عامل اکسید کننده ) سولفات سدیم انیدر ( بالا آورنده نقطه جوش  محلول )و یک كاتالیزور هضم می شود . در نتیجه عمل هضم ، نیتروژن ماده غذایی به جز نیتروژن نیترات ها و نیتریت ها به سولفات آمونیوم تبدیل می شود که بعد از حرارت دادن آن با هیدروکسید سدیم در مجاورت بخار به گاز آمونیاک تبدیل می گرددو گاز آمونیاک در محلول اشباع اسید بوریک جمعآوری می گردد . سپس با تیتراسیون توسط اسید کلریدریک استاندارد بورات آمونیوم اندازه گیری شده و میزان نیتروژن تخمین زده می شود .

فرمول واکنش ها به شرح زیر است  :

  ( NH4 ) 2SO4 ( ماده غذایی ) N  2NH3  + 2 H₂O  + Na ₂SO4    NaoH2 + SO_4 2(NH4)(1)                                                                           NH₄H₂BO₃                                                  H₃BO₃ 2 + NH₃2(2)                                                                            H₃BO₃                + NH₄CL 2  HCL 2 + NH₄H₂BO₃ 2 از جمع فرمولهای 1 و 2 ، واکنش کلی زیر حاصل می شود:NH₄CL  2  HCL2 + NH₃  2

ب ) وسایل و مواد لازم- ترازوی آزمایشگاهی - اجاق هضم کجلدال - لوله های مخصوص هضم و تقطیر کجلدال- دستگاه تقطیر اتوماتیک کجلدال ( دستگاههای موجود در آزمایشگاه صنایع شیر از نوع VAPODEST20 ساخت شرکت JERHARDT است که دستورالعمل آن ضمیمه می باشد).- یورت- اسید سولفوریک غلیظ (98%) - کاتالیزور : از قرص های آماده بنام  KJELTAB می توان استفاده کرد.

در صورت عدم دسترسی به قرص فرمول تهیه کاتالیزور به شرح زیر است :

 96 گرم سولفات سدیم انیدر 5/3 گرم سولفات مس متبلور و 5/0 گرم دی اکسید سلنیوم را مخلوط کنید .- معرف رنگی قرمز متیل و سبز برموکرزول : 2/0 گرم قرمز متیل و یک گرم سبز برموکرزول را در 600 میلی لیتر اتانول 95% حل کنید ( این معرف به صورت اماده بنام M 5  توسط شرکت مرک تولید می شود . ).

 - محلول سود 32 % - محلول اسید بوریک 2%  با معرف رنگی : 20 گرم اسید بوریک " H₃BO₃  " را در آب وقطر حل کرده  و تا یک لیتر رقیق نمایید و 3  میلی لیتر از معرف رنگی بند هشتم را به آن اضافه کنید که محلول به رنگ بنفش ارغوانی در می آید . - محلول اسید کلریدریک  نرمال

 ج ) روش کار : * هضم : دو قرص کاتالیزور ( یا 8 گرم مخلوط کاتالیزور ) و 20 میلی لیتر  اسید سولفوریک و حدود 5 گرم شیر را داخل لوله هضم کجلدال  ریخته و ان را روی اجاق هضم قرار دهید . ابتدا دمای اجاق را در حدود 250 – 230 درجه سانتی گراد تنظیم کنید و پس از نیم ساعت  که حالت کف کنندگی در مخلوط متوقف شد دما را به 410 درجه سانتی گراد افزایش دهید . صبر کنید تا نمونه کاملاً شفاف شود . ( حدود یک ساعت در 420 درجه سانتی گراد زمان لازم است ) . سپس حدود 5/1 ساعت دیگر صبر کنید تا هضم کامل شود وبعد لوله حاوی نمونه هضم شده  را  تا 40 درجه سانتی گراد خنک نمایید . * تقطیر بعد از افزودن 80 میلی لیتر آب مقطر و 80 میلی لیتر سود  32 % به نمونه ، آنرا زیر دستگاه تقطیر قرار داده و در قسمت دریافت کننده دستگاه یک ارلن مایر حاوی  حدود 70 میلی لیتر اسید بوریک 2 درصد ( با معرف رنگی )  بگذارید . بطوری که انتهای لوله در داخل اسید بوریک قرار گیرد . نمونه به مدت 4 دقیقه تقطیر می شود و آمونیاک در محلول اسید بوریک جمع آوری می گردد . رنگ محلول از بنفش به سبز تغییر می یابد .

          یتراسیون

         محلول ایسد بوریک را با اسید کلرید ریک 10 / 1 نرمال تا تغییر رنگ به بنفش تیتر نمایید . و حجم ایسد کلرید ریک مصرفی را یادداشت نمایید .

 یاد آوری : جهت حذف عوامل خطا باید یک لوله شاهد نیز در کنار لوله حاوی نمونه آزمایش شود . بدین منظور باید به جای نمونه 5 میلی لیتر آب بکار روی و همه مراحل هضم و تقطیر و تیتراسیون بر روی آن انجام شود .  

د ) محاسبه و تفسیر نتایج       ](میلی لیتر حجم آب مصرفی برای شاهد ) – (میلی لیتر اسید مصرفی برای نمونه )[ * نرمالیته اسید کلرید ریک * 4007/1= درصد نیتروژن وزن نمونه اولیه( گرم ) 38/6 * درصد نیتروژن = درصد پروتئین

هـ ) تکرار پذیری حداکثر اختلاف بین دو آزمایش متوالی نباید بیش از 03/0 درصد باشد .

1-5-2 ) اندازه گیری کازئین کازئین شیر را می توان به وسیله اسید رقیق ویا آنزیمهایی مثل پپسین یا رنین رسوب داد و مقدار آن را بر حسب ازت به وسیله روش کلدال اندازه گیری نمود . -        

روش آزمون 5 گرم شیر را در یک بشر 100 میلی لیتری توزین کنید و 50 میلی لیتر آب گرم 40 درجه سانتی گراد به آن افزوده و 5 /0 میلی لیتر محلول اسید استیک ( 10 % ) به آن اضافه کنید  . پس از 10 دقیقه 5/0 میلی لیتر  استات سدیم نرمال اضافه کرده و آن را به هم بزنید . پس از سرد شدن آن را از یک کاغذ صافی عبور داده صاف کنید . بشر را 3 مرتبه با  مقداری آب مقطر شسته و از روی آن عبور دهید . رسوب روی کاغذ صافی را مجددا شسته و سپس کاغذ صافی حاوی رسوب کازئین را در بالن هضم کلدال انداخته طبق روش 2- 5- 1 مقدار ازت تام را اندازه گیری نمایید . برای تعیین کازئین مقدار ازت تام را در ضریب 38/6 ضرب کنید . کازئین شیر طبیعی 80 % پروتئین کل را تشکیل می دهد .

  تشخیص مواد بازدارنده رشد میکروبی و....

 3 –تشخیص مواد بازدارنده رشد میکروبی در شیر بازدارنده های رشد میکروبی را می توان به گروه های زیر تقسیم کرد:الف ) ترکیباتی که به طور طبیعی در شیر وجود دارند مانند لاکتنین – سیستم لاکتو پر اکسیداز – لوکوسیتها که در شیر ورم پستانی – استفاده دام از انواع معینی علوفه مانند علوفه کپک زده و شلغم که باعث ایجاد عوامل بازدارنده در شیر می شوند. ب) بازدارنده های شیمیایی شامل :- باقیمانده آنتی بیوتیکها – آنتی بیوتیکهایی که معمولاً برای درمان ورم پستان گاو به کار می رود عبارت است از : پنسیلین ، استرپتومایسین ، نئومایسین ، کلرانفنیکول ، تتراسیکلین ، سولفانامیدها .

باقیمانده آنتی بیوتیکها در شیر خطری بالقوه برای بهداشت همگانی محسوب شده و مقادیر کم آن بر باکتریهای استارتر اثر گذاشته و باعث افت کیفیت فرآورده های تخمیری شیر می شود.

-         باقیمانده مواد پاک کننده و ضد عفونی کننده ناشی از سهل انگاری یا برنامه ریزی غلط یا سیستم معیوب CIP در تجهیزات دامداری یا کارخانه. همچنین در موارد نادر ممکن است برخی از دامداران ترکیبات ضد میکروبی به شیر اضافه نمایند تا قابلیت نگهداری آنرا افزایش دهند.

-         باقیمانده حشره کشها به علت آلودگی شیر بعد از دوشش یا تغذیه دام با علوفه ای که به آن حشره کش پاشیده اند.

-         افزودن مواد نگهدارنده برای جلوگیری از فساد شیر و کاهش بار آلودگی تقلب محسوب می شود این مواد غالباً شامل آب اکسیژنه ، فرمالدئید و هیپوکلریت ها می باشند .

یادآوری:تشخیص مواد بازدارنده رشد میکروبی شامل ترکیبات طبیعی شیر

(بند الف) نمی شود و عمدتاً منظور بازدارنده های شیمیایی است .

3– 1 ) جستجوی آنتی بیوتیکها متاسفانه ممکن است آنتی بیوتیکهایی که در معالجه بیماریهای دام به صورت تزریق و یا از راه دهان مصرف می شوند وارد شیر گردد.

 وجود باقی مانده آنتی بیوتیک در شیر حائز اهمیت است این باقیمانده می تواند سبب واکنشهای آلرژیک و یا موجب افزایش دز درمان با آنتی بیوتیک گردیده و تاثیر نامطلوبی روی محیط کشت استارتر ها داشته باشد.

 روشهای مختلف در تشخیص آنتی بیوتیک شامل بطور کلی روشهای میکروبی

( توقف رشد باسیلوس سوبتیلس و یا باسیلوس استارو ترموفیلوس کاربری زیادی دارد)

 یا تکنیکهای ایمونولژی و آنزیمی جهت تعیین بتالاکتامها و سایر آنتی بیوتیکها و روشهایی بر اساس آزمایش آنتی بادی خاص برای هر یک از آنتی بیوتیکها می باشند.روشهای قابل اجراء در کارخانجات انجام تست انعقاد و یا استفاده از کیت های تشخیص آنتی بیوتیک در شیر است.بر اساس روشهای میکروبی ، روشی که انجام آن در کارخانجات یا مراکز جمع آوری میسر است توضیح داده می شود.

3-1-1 ) تست انعقاد

 الف) اساس آزمایش عبارت است از : تخمیر نمونه مشکوک به وسیله باکتری های لاکتیک  ترموفیل (مایه ماست معمولی ) و اندازه گیری اسیدیته بعد از 3 ساعت انکوباسیون . میزان اسیدیته حاصل باید با اسیدیته نمونه شیر شاهد (عاری ازمواد بازدارنده ) مقایسه شود .

 ب) وسایل و مواد لازم - لوله های آزمایش متوسط - باکتری های آغازگر (استارتر ماست )

- پی پت 10 میلی لیتری

- پی پت 1 میلی لیتر- حمام آب گرم یا انکوباتور  تنظیم شده در 2 42 درجه سانتی گراد

- تجهیزات اندازه گیری اسیدیته

ج ) روش آزمایش : 10 میلی لیتر نمونه شیر مشکوک و 10 میلی لیتر نمونه شیر شاهد را در لوله های آزمایش ریخته و آنها را به مدت 5 دقیقه در آب جوش قرار دهید . پس از اینکه لوله های حاوی شیررا تا دمای انکوباسیون (42 – 40 ) درجه سانتی گرادخنک کردید ، و هرکدام ازآنها یک میلی لیتر استارتر ماست اضافه کرده و مخلوط نمایید و 3ساعت در دمای انکوباسیون قراردهید . اگر میزان اسیدیته نمونه مشکوک به طور محسوسی حدود 10 درجه در نیک کمترازنمونه شیر طبیعی باشد .این شیر حاوی آنتیبیوتیک یا سایر مواد بازدارنده است.

یادآوری :

1 ) در این روش معمولاً بعد از 2  ساعت لخته تشکیل می شود و در صورتی که میزان مواد بازدارنده شیر زیاد باشد هیچ گونه لخته ای تشکیل نمی شود .

اما برای اطمینان از صحت نتیجه آزمایش بهتر است اسیدیته نمونه مشکوک بعد از 3 ساعت کنترل شود .

2- این آزمایش ، روشی ساده و ارزان برای تشخیص مواد بازدارنده است و دارای دقتکافی برای مقاصد عملی می باشد . (جدا کردن شیر آلوده و انتخاب شیر مناسب برای تولید ) اما تشخیص نوع و میزان مواد بازدارنده در این آزمایش امکان پذیر نیست

3 ) در صورت دسترسی آزمایشگاه به کیت های تشخیص آنتی بیوتیک ها، آزمایش باید براساس دستور راهنمای کیت مروبطه انجام شود .

 4 ) شیر گاو تحت درمان با آنتی بیوتیک باید پس از طی دوره درمان حداقل بمدت 72 ساعت به کارخانجات تحویل نگردد . در صورتی که نتیجه آزمایش شیر دامداری مثبت یا مشکوک باشد بایستیبه مدت 3 روز آزمایش را تکرار کنید .

 5 ) برای تهیه شیر شاهد می توان شیر بازساخته به نسبت 10 % پودر شیر خشک که قبلا مورد آزمایش قرار گرفته مورد استفاده نمود .3-1-2 ) استفاده از کیت های تشخیص آنتی بیوتیک کیت هایی که بطور وسیع  بعنوان روش سریع در اکثر کشورها مرسوم و در ایران نیز شناخته شده اند. استفاده از کیت بتااستار (betastar  ) ودلووتست (DELVOTEST ‌) است . کیت (betastar  ) بر اساس تکنیک های آنزیمی و عیار سنجی آنتی بیوتیک های بتالاکتام می باشد .زمان آزمایش با استفاده از این کیت ها 5 دقیقه و برای تشخیص آنتی بیوتیک در خط دریافت شیر مناسب میباشد . کیت های دلووتست روش تشخیص میکروبی  براساس حساسیت باسیلوس استئاروترموفیلوس نسبت به آنتی بیوتیک میباشد  و زمان آزمایش حدود 6 ساعت می باشد.در هر حال درمواقعی که از کیت برای تشخیص آنتیبیوتیک استفاده می شود باید روش کاملاً مطابق دستورالعمل ارائه شده از طرف سازنده صورت گیرد .

3-2 ) تشخیص باقیمانده مواد پاک کننده و ضدعفونی کنندهاین مواد معمولاً براثر سهل انگاری و کافی نبودن عملیات شستشوی دستگاههای شیر دوشی و مخازن در شیر باقی می ماند .اگر مقدار باقیمانده مواد پاک کننده و ضدعفونی کننده زیاد بوده و یا غلظت آن بالا باشد ، بو و طعم شیر تغییر می کندو به آسانی قابل تشخیص است با آزمایش مواد بازدارنده رشد میکروبی( تست انعقاد ) ، این مواد به طور کلی و بدون تعیین نوع مواد قابل تشخیص می باشد.

1-       3 ) تشخیص آب اکسیژنه در شیر خامافزودن آب اکسیژنه به شیر باعث از بین بردن یا کند شدن رشد باکتریهای شیر شده و ترش شدن شیر را به تعویق می اندازد. برای تشخیص آب اکسیژنه دو روش پیشنهاد می شود:3-3-1) تشخیص به وسیله گایاکلالف ) مواد شیمیایی لازم

-         گایاکل : محلول اشباع شده 2%

ب) اساس روش : شیر حاوی آنزیمی است که آب اکسیژنه را به آب اکسیژن فعال تجزیه می کند. این آنزیم پرواکسیداز نام دارد. اکسیژن آزاد با گایاکل تولید هیدراکسی متوکسی دوبنزن می کند که صورتی رنگ است.

ج) روش آزمایشبه وسیله پی پت  یک میلی لیتر از نمونه شیر مشکوک و یک میلی لیتر شیر معمولی و یک میلی لیتر از محلول اشباع شده به گایاکل را در لوله آزمایش بریزید و تکان دهید. دمای نمونه هنگام آزمایش باید 30 درجه سانتی گراد باشد. تغییر رنگ در فاصله یک درجه دلیل وجود آب اکسیژنه در شیر می باشد. این آزمایش در مورد شیر های ترش و یا حرارت دیده و شیر مانده ( آب اکسیژنه به ترتیب به وسیله کاتالاز موجود در شیر تجزیه می شود) نتیجه ندارد.3-3-2) تشخیص به وسیله سدیم ارتووانادیت الف) مواد شیمیایی لازم

-         سدیم آرتووانادیت ( sodium orthovanadate)

-         اسید سولفوریک: 10% حجمی

-         یک گرم سدیم ارتووانادیت را در 100 میلی لیتر اسید سولفوریک حل نمایید. از این معرف برای تشخیص آب اکسیژنه استفاده میشود

ب) روش آزمون در یک لوله آزمایش 10 میلی لیتر از نمونه شیر بریزید و به آن از معرف فوق اضافه نمایید. ظهور رنگ قرمز دلیل وجود آب اکسیژنه در شیر می باشد.

3-4) تشخیص فرم آلدئید

الف) مواد لازم

-         اسید سولفوریک غلیظ

-         کلر ورفریک 5/2 % ب) روش آزمون در یک لوله آزمایش 5 میلی لیتر از شیر مشکوک و معادل آن آب بریزید و 3 تا 4 میلی لیتر اسید سولفوریک به آن بیافزایید. سپس 2 قطره کلرورفریک به نمونه اضافه کرده پس از مخلوط کردن تا نقطه جوش حرارت دهید. ظاهر شدن رنگ بنفش نشان دهنده وجود فرمالین در شیر است

یادآوری :ظهور رنگ بنفش در فاز چربی و روش ژربر می تواند به دلیل افزایش فرمالین به شیر خام باشد.

3- 5 ) تشخیص هیپوکلریتها از آنجائیکه هیپوکلریتها از مواد ضد عفونی کننده معمولی می باشند امکان استفاده از آن به منظور کاهش بار آلودگی زیاد است . هیپوکلریت ها قادرند یدور ها را تجزیه کرده و ید آزاد نمایند که ید با نشاسته رنگ آبی تولید می کند. بعضی اکسیدانها به خصوص آب اکسیژنه نیز واکنش مشابه ای دارد بدین جهت در مواردی که واکنش مثبت است قبل از نتیجه گیری ، شیر باید از نقطه نظر وجود آب اکسیژنه مورد آزمایش قرار گیرد

 الف ) مواد لازم -        

یدور پتاسیم : محلول 10 %

-         نشاسته : مقدار کمی نشاسته را به 10 میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده و می جوشانیم و پس از سرد شدن بلافاصله استفاده می نماییم . ب ) روش آزمون دو میلی لیتر شیر و 1 میلی لیتر آهار نشاسته و 1 میلی لیتر محلول تازه یدور پتاس را در یک لوله آزمایش ریخته و خوب تکان می دهیم . اگر مخلوط سفید باقی ماند شیر فاقد هیپوکلریت است . ایجاد رنگ آبی خاکستری دلیل وجود هیپوکلریت در شیر می باشد .

فهرست منابع مورد استفاده :

1-       کاتالوگ شرکت gerhardt  دستگاه میکرو  vap20

2-       اندازه گیری چربی شیر با روش ژربر کاتالوگ  راهنمای شرکت  funkegerber

3-       استادنارد ملی ایران ، شماره 638 ، تعیین وزن مخصوص شیر ، روش لاکتودانسی متر

 4-       استاندارد ملی ، شماره 3543 . تعیین نقطه انجماد شیر ، روش ترمیستوری .

 5-       کاتالوگ کریوسکوپ advanced  مدل 2D  4 .

 6-       سخنرانی خانم دکتر بوکلمن در سمینار تترا پاک 1373 .

 7 – harding , f. 1995 . " milk quality "

 8 – marshal ,R . 1993 ." standard methods  for examination of dairy products "

 9 – IDF standard 108 , 1982

 10 – IDF standard 152A , 1997

 11- ISO 5764 , 1987

12 – joint committee of the milk marketing board 1988

 13 –AOAC official method 990 . 22, 1995 . ssss